流產(chǎn)物拷貝數(shù)變異（Copy Number Variation, CNV）檢測，是指通過對妊娠期流產(chǎn)/引產(chǎn)組織、絨毛、臍帶血樣本進行全基因組測序，從而判斷流產(chǎn)組織染色體是否存在變異的一種技術(shù)。結(jié)合夫妻雙方的遺傳背景，該技術(shù)可為孕婦不明原因流產(chǎn)尋找可能的遺傳因素，發(fā)現(xiàn)流產(chǎn)發(fā)生的根源，幫助醫(yī)生從更科學(xué)的角度合理的指導(dǎo)夫婦再次備孕。
在真邁生物2020年度國產(chǎn)測序平臺及應(yīng)用創(chuàng)新論壇上，時任上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬國際和平婦幼保健院（以下簡稱“國婦嬰”）生殖遺傳科主任的徐晨明教授（注：徐教授現(xiàn)已就職于復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院）就孕婦流產(chǎn)原因及篩查方法做了詳細的報告，并結(jié)合臨床研究案例分享了使用單分子測序平臺GenoCare 1600進行CNV-seq檢測的優(yōu)勢和經(jīng)驗。
有多少自然流產(chǎn)是由CNV引起的？
自然流產(chǎn)是指由于非人為因素導(dǎo)致妊娠在28周前終止且胎兒體重<1000g的流產(chǎn)，其發(fā)生率占全部妊娠的約15%~20%，其中80%以上為早期自然流產(chǎn)。
自然流產(chǎn)主要由3大因素引起：一是藥物、酒精、化學(xué)制劑、細菌、病毒等環(huán)境因素；二是內(nèi)分泌異常、免疫功能異常、宮頸功能不全、子宮畸形、血栓形成、年齡、BMI、吸煙等母體因素；三是染色體疾病、單基因疾病、基因組疾病、多基因疾病等遺傳因素。
而在這三種引起自然流產(chǎn)的因素中，早期自然流產(chǎn)約有50%-60%是由染色體異常導(dǎo)致的。染色體異常會影響眾多基因的表達和作用，破壞基因的平衡狀態(tài)，從而妨礙胎兒相關(guān)器官的分化、發(fā)育及某些功能發(fā)生異常而引發(fā)胎停、流產(chǎn)。
染色體導(dǎo)致的致病因素包括染色體數(shù)目異常（約占86%）、結(jié)構(gòu)異常（約占6%），以及嵌合體（約占8%）。流產(chǎn)的孕周越小，檢出的染色體異常比例越大。
CNV檢測有哪些方法？
美國生殖醫(yī)學(xué)會建議在流產(chǎn)后進行相關(guān)檢查來查明流產(chǎn)原因，例如通過核型分析、染色體微陣列分析技術(shù)（chromosome microarray analysis, CMA）對夫妻雙方及胎兒流產(chǎn)物進行檢測從而判定是否存在染色體異常。
常見CNV篩查方法及特點對比：
核型分析檢測周期長、分辨率低，無法檢出5Mb以下CNVs。
CMA通量低、成本高、探針覆蓋范圍有限，無法準(zhǔn)確分析＜30%的嵌合體。
CNV-seq技術(shù)無需細胞培養(yǎng)，測序完成后，通過計數(shù)每條染色體拷貝數(shù)的細微改變，來精確判斷嵌合體比例，故CNV-seq可以實現(xiàn)對低比例嵌合體更好的檢測，可為臨床醫(yī)生提供更為準(zhǔn)確可靠的產(chǎn)前診斷結(jié)果。
CNV-seq技術(shù)優(yōu)點
檢測范圍廣：包括非整倍體、大片段缺失重復(fù)、全基因組CNV
高通量：同時進行多個樣本的檢測
操作簡便：流程簡便，節(jié)省人力
兼容性好：一臺測序儀可同時開展NIPT與CNV-seq
檢測周期短：基因測序、自動化數(shù)據(jù)分析、質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)清晰，報告周期短
分辨率高：可檢測低至100Kb的CNV
低比例嵌合的檢測：可檢測低至5%的染色體非整倍體嵌合，在臨床樣本中可發(fā)現(xiàn)超過10%的染色體非整倍體嵌合
CNV-seq還有哪些痛點有待解決？
傳統(tǒng)的建庫過程需經(jīng)過PCR進行DNA片段的富集，而在富集的過程中會不可避免的引入擴增錯誤和偏向性，這意味著上機測序的文庫片段已經(jīng)無法真實反映原始樣本的情況，同時也帶來dup偏高、測序數(shù)據(jù)浪費偏多的問題。這對檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，尤其對于微缺失/重復(fù)（CNV）檢測，會造成比較大的影響。
嵌合的檢出缺憾：由于富集引入的PCR bias對于較低比例的嵌合，也帶來了檢出困擾。
單分子測序平臺GenoCare為何能解決CNV-seq痛點？
GenoCare gDNA文庫構(gòu)建試劑盒將DNA片段化、末端修復(fù)以及末端加dA尾合并為一步，產(chǎn)品無需純化，可直接進行接頭連接，采用一管式操作，流程簡化，操作簡便，且無PCR過程，可極大縮短建庫時間。
GenoCare與其他測序平臺樣品處理過程對比：
2 最大程度利用樣品，保持樣品的多樣性和原態(tài)性
GenoCare與其他測序平臺樣品處理及質(zhì)控結(jié)果對比：
GenoCare 1600測序平臺：樣品投入量15-50ng
其他測序平臺：樣品投入量約1ug
3 在線分析系統(tǒng)，為臨床工作人員提供一鍵化的結(jié)果
4?GC bias影響極小，為低比例嵌合樣品的檢出提供穩(wěn)定保障
整個樣品制備和測序過程并沒有PCR, 可以極大程度解決二代測序引物的GC偏好性，從而提高對于小片段微缺微重樣品及較低比例嵌合異常的樣品的檢出。
GC bias 經(jīng)多次重復(fù)測試均值約0.02-0.04，為低比例嵌合樣品的檢出提供了穩(wěn)定的保障。
單分子測序平臺GenoCare在CNV-seq檢測中的臨床案例檢出結(jié)果舉例
真邁生物開發(fā)的基于單分子測序平臺的流產(chǎn)物CNV的整套解決方案，在國婦嬰完成了共計500例的流產(chǎn)物樣品檢測，初期選擇了150例各種類型的陽性樣品進行雙盲測試，測試結(jié)果與其他NGS測序平臺結(jié)果完全一致。部分CNV檢出結(jié)果示例：
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參考文獻：
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